Клинические испытания и исследования

Секретируемые меланомой лизосомы запускают апоптоз дендритных клеток, происходящий из моноцитов, и ограничивают иммунотерапию рака

Исследование

Недавний успех терапии блокадой контрольных точек сделал иммунотерапию одним из наиболее многообещающих методов лечения меланомы. Тем не менее, полный лечебный ответ после иммунотерапии наблюдается только у части пациентов. Чтобы определить, какие факторы ограничивают эффективность иммунотерапии, мы создали мышиные модели, которые перестают реагировать на иммунотерапию, как только их опухоли превышают определенную стадию. Анализ иммунных систем организмов показал, что количество опухоле-инфильтрирующих дендритных клеток (ОИДК) со временем резко уменьшалось. Кроме того, в отличие от существующей парадигмы, после того, как меланома была установлена, TIDC не мигрировала в сигнальные лимфатические узлы. Вместо этого они подверглись локальной гибели клеток из-за чрезмерного фагоцитоза лизосом. Важно,+ Т-клетки, а в их отсутствие Т-клетки не лизировали клетки меланомы. Наши результаты предлагают сдвиг парадигмы в отношении роли TIDC и основы для повышения эффективности иммунотерапии.Значение:

Эта работа переопределяет роль дендритных клеток, происходящих из моноцитов, при меланоме и предлагает новую стратегию повышения эффективности иммунотерапии на основе Т-клеток у пациентов, не отвечающих на лечение.

Графическая абстракция

графика

Введение

Пациенты с прогрессирующей меланомой имеют очень плохой прогноз и должны пройти серию мучительных курсов химиотерапии, ингибиторов онкогенов или комбинированной терапии ( 1 ). В ряде основополагающих работ установлена ​​прямая корреляция между высокой частотой цитотоксических Т-клеток в опухолевой массе и улучшением клинических исходов ( 2, 3 ). В результате многие недавние и продолжающиеся клинические испытания пытались использовать цитотоксические способности Т-клеток для искоренения меланомы. Новаторские методы лечения, основанные на экспансии de novo инфильтрирующих опухоль цитотоксических Т-клеток и их реинфузии пациенту, продемонстрировали способность иммунной системы опосредовать отторжение опухоли ( 4, 5) .). Недавно у пациентов с меланомой, получавших лечение блокирующими антителами, направленными против супрессивных рецепторов на Т-клетках, наблюдался клинический ответ ( 6, 7 ). Тем не менее, полный лечебный ответ наблюдается только у части пациентов, что подчеркивает необходимость улучшения иммунотерапии ( 8, 9 ). Учитывая высокую частоту мутаций при меланоме, несколько удивительно, что у хозяина не вырабатывается эффективный Т-клеточный иммунитет против опухолевых клеток ( 10 ). Общее мнение предполагает, что способность опухолевых клеток редактировать представленный ими антиген и их способность способствовать супрессивному микроокружению — это то, что ограничивает количество инфильтрирующих меланому цитотоксических Т-клеток с ограниченным репертуаром Т-клеточных рецепторов (TCR) ( 11–14 ).).

Одним из способов увеличения распространенности опухоле-реактивных Т-клеток является использование возможностей представления антигена дендритными клетками (ДК) и их способности активировать цитотоксические Т-клетки ( 15 ). ДК состоят из гетерогенных клеточных популяций, которые различаются по своей морфологии, мембранным рецепторам, распределению в тканях, способности к миграции и презентации антигена ( 16-18 ). Текущее понимание онтогенеза ДК предполагает, что они состоят из четырех основных подмножеств, состоящих из плазмоцитоидных ДК (пДК), классических ДК 1 типа (кДК1), классических ДК 2 (кДК2) и ДК, происходящих из моноцитов (MoDC; ссылка 18 ) . . Хотя некоторые подмножества DC, такие как CD103 + /CD141 + или CD8 +cDC являются превосходными антигенпрезентирующими клетками, их распространенность в опухолях и крови ограничена ( 19, 20 ). Вакцинация неоантигенами MHC-I и II после резекции очагов меланомы стадии IIb/c может предотвратить рецидив опухоли у людей ( 21, 22 ). Однако на сегодняшний день попытки использовать ДК для устранения установленного иммунитета к меланоме показали неутешительные результаты в клинических условиях ( 23 ).

Картируя молекулярный механизм, который регулирует обработку антител, связывающихся с опухолью, с помощью ДК, мы недавно создали один из самых мощных иммунотерапевтических препаратов на основе ДК для лечения рака у мышей ( 24, 25 ). Интересно, что хотя это лечение оказалось эффективным, когда опухоли были меньше 20 мм 2 , оно было почти инертным, когда средний размер опухолей превышал примерно 40 мм 2 . Изучение большинства сообщений об иммунотерапии на моделях мышиной меланомы (например, ret , B16F10 и Braf V600E /PTEN -/- ) показало, что они ограничены ранней стадией и относительно небольшими опухолями ( 19, 26-30 ).

Мы использовали невосприимчивость крупных опухолей к моделированию пациентов с меланомой, которые не реагируют на иммунотерапию. Мы обнаружили, что, в отличие от современной парадигмы, инфильтрирующие меланому MoDC не мигрируют в сигнальные лимфатические узлы, а скорее необходимы in situ для лицензирования цитотоксической активности CD8 + T-клеток. Мы также продемонстрировали, что MoDC подвергаются апоптозу в результате поглощения ими лизосом, секретируемых меланомой, и их отсутствие ограничивает эффективность иммунотерапии. Хотя эти модели не полностью отражают сложность болезни человека, принцип, лежащий в основе их способности избегать иммунного давления, может быть применим к болезни человека.

Материалы и методы

Мыши

Мыши дикого типа (WT) C57BL/6 были получены от Envigo. Мыши B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J были приобретены у Jackson Laboratories. Мыши B6.Cg-Ptprca Tg (UBC-PA-GFP)1Mnz/J были получены от доктора Зива Шульмана (Институт Вейцмана, Реховот, Израиль). Мыши CD11C-DTR были получены от профессора Якуба Абрамсона (Институт Вейцмана). Мыши с нокаутом NLRP3 были получены от профессора Неты Эрез (Тель-Авивский университет, Тель-Авив, Израиль). Все мыши содержались в аккредитованном Американской ассоциацией по аккредитации лабораторных животных животноводческом комплексе и содержались в специальных условиях, свободных от патогенов. Эксперименты на животных были одобрены и проводились в соответствии с аккредитацией лабораторий Тель-Авивского университета № 01-16-095. Во всех экспериментах использовали самцов и самок мышей в возрасте от 8 до 12 недель.

Сотовые линии

Клетки B16F10 (CRL-6475) и YUMM 1.7 (CRL-3362) были приобретены у ATCC в январе 2017 года, а клетки меланомы Ret были любезным подарком профессора Неты Эрез из Тель-Авивского университета. Аутентификация Ret была подтверждена с помощью секвенирования генома ферментов пути MAPK. Клеточная линия А375 была любезным подарком профессора Тамар Гейгер из Тель-Авивского университета. Аутентификация A375 была выполнена в Центре геномики компании BioRap Technologies и Исследовательском институте Раппапорта в Технионе, Израиль. Профили коротких тандемных повторов определяли с использованием набора Promega PowerPlex 16 HS. HEK-293FT были приобретены у Thermo Fisher Scientific в январе 2017 г. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% термоинактивированной FBS, 2 ммоль/л л .-глутамин и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (все от Biological Industries). YUMM 1.7 культивировали в полной среде DMEM:F12. Клетки Melan-A были приобретены в банке клеток Welcome Trust Functional Genomics в феврале 2019 года и дополнены 200 нмоль/л форбол-12-миристат-13-ацетата (Santa Cruz Biotechnology). Первичные кератиноциты были любезным подарком доктора Чена Люксембурга (Тель-Авивский университет) и культивировались, как описано в ref. ( 31 ). Все клетки обычно тестировали на микоплазму (набор для тестирования микоплазмы EZ-PCR, Biological Industries).

Модели опухолей in vivo

Для исследования опухоли меланомы 2 × 10 5 клеток B16F10 или YUMM1.7 или 5 × 10 5 клеток ret суспендировали в 50 мкл среды и вводили подкожно мышам C57BL/6 над правым боком. Размер растущих опухолей измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля. Когда опухоли достигали 200 мм 2 , мышей умерщвляли по этическим соображениям.

Выделение ДК и Т-клеток

Все препараты тканей получали одновременно от каждой отдельной мыши (после эвтаназии путем ингаляции CO 2 ). Периферическую кровь (ПБ) собирали посредством перфузии правого предсердия сердца (сбалансированный солевой раствор Хэнка, HBSS, с 10 ммоль/л ЭДТА) в вакуумную пробирку, покрытую гепарином натрия. Мононуклеарные клетки собирали после центрифугирования на среде с градиентом плотности Histopaque-1077 Hybri-Max (Sigma Aldrich).

Селезенку и лимфатический узел гомогенизировали в HBSS с добавлением 2% FBS и 5 ммоль/л ЭДТА через фильтр 70 мкм (Thermo Fisher Scientific). Опухоли расщепляли в RPMI 1640 с 2 мг/мл коллагеназы IV, 2000 ед/мл ДНКазы I (оба от Sigma Aldrich) и 50 нг/мл GMCSF (Peprotech) в течение 40 минут при 37°C с магнитными мешалками (200 об/мин). . Клетки CD11b + выделяли с использованием магнитных CD11b MicroBeads и колонки (обе от Miltenyi Biotec), инкубировали в течение 2 часов в полной RPMI 1640 при 37°C, а свободно прилипшие клетки сортировали с помощью FACSAriaII как клетки FSC low SSC low .

Для выделения Т-клеток клетки инкубировали с магнитными шариками анти-CD4 или анти-CD8 (MojoSort Nanobeads, BioLegend) в соответствии с инструкциями производителя. Т-клетки культивировали в RPMI 1640 с добавлением 1% Pen-Strep, 10% термоинактивированной FBS, 1% пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот MEM-Eagle, 1% инсулина-трансферрина-селена (PeproTech) и 50 мкмоль /л β-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich) и добавляли 1000 МЕ/мл рекомбинантного мышиного IL2 (PeproTech) на планшетах для тканевых культур, предварительно покрытых 0,5 мкг/мл анти-CD3-антителами (клон 17A2, Biolegend).

Лентивирусная инфекция

Лентивирус получали, как описано ( 32 ), вкратце, клетки HEK-293FT трансфицировали плазмидами pLVX, содержащими васаби, или tdTomato под промотором EF1 вместе с psPAX2 (подарок от Didier Trono, плазмида Addgene # 12260) и pCMV-VSV-G ( подарок Боба Вайнберга, плазмида Addgene # 8454). Среды, содержащие вирусы, собирали через 24 и 48 часов. Для инфицирования клетки В16 инкубировали с вирусами и 100 мкг/мл полибрена (Sigma Aldrich) в течение 30 минут с последующим 30-минутным центрифугированием перед заменой среды. Через 3 дня клетки, которые экспрессировали васаби, TRP1-GFP или tdTomato, сортировали с помощью FACSAriaII.

Ретровирусная инфекция

Ретровирусы были приготовлены, как описано ( 32 ). Вкратце, клетки Platinum E (подарок профессора Сирила Коэна, Университет Бар-Илан) трансфицировали плазмидами pMIGII и PCL-Eco в молярном соотношении 2:1 (оба были любезно предоставлены профессором Дарио А.А. Виньяли). Через 48 часов вирусы центрифугировали в течение 1 часа при 100 000 rcf и суспендировали в 1 мл среды в течение ночи при 4°C. Селезеночные CD8 + T-клетки культивировали на планшете, предварительно покрытом анти-CD3 (0,5 мкг/мл) с IL2 (1000 МЕ/мл). Затем к каждым 2 × 10 6 CD8 + Т-лимфоцитам добавляли по 0,3 мл концентрированных ретровирусов с полибреном в концентрации 10 мкг/мл. Клетки инкубировали в течение 30 минут и центрифугировали при 500 rcf в течение 1 часа. Среду заменяли и Т-клетки культивировали еще 3 дня.

Адаптивный перенос Т-клеток

Мышам с 8–10-дневными опухолями B16F10 (средний размер 25 мм 2 ) вводили 1 × 10 6 gp100-TCR, экспрессирующих CD8 + Т-клетки ( 26 ), на мышь после сублетального облучения (600 рад) с последующим внутрибрюшинным введением 300 000 МЕ ИЛ-2 (PeproTech) в течение 4 дней подряд. Для повышения жизнеспособности ДК перед переносом CD8 + Т-клеток в опухоли на поздних стадиях необлученным мышам-реципиентам внутрибрюшинно вводили 80 мкг/мышь анти-CD40 и 1 мкг/мышь рекомбинантного GMCSF.

Иммунотерапия опухолей

Мышам инъецировали внутрь опухоли 80 мкг антитела против CD40 (клон FGK4.5; BioXCell), 0,2 мкг TNFα (BioLegend) и 100 мкг/мышь антитела против TRP1 (клон TA99; BioXCell). CpG ODN1826 и PolyI:C вводили в течение 3 дней подряд (50 и 100 мкг соответственно, оба от InvivoGen). Для эксперимента с высокими дозами вводили 0,5 мкг TNFα, 200 мкг анти-CD40, 400 мкг анти-TRP1, 100 мкг CpG ODN1826 и 200 мкг PolyI:C. Блокада контрольно-пропускного пункта проводилась так, как описано Тваймен-Сент-Виктор и его коллегами ( 33 ).) с небольшими изменениями. Вкратце, мышей с опухолями анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 100 мг/кг кетамина плюс 10 мг/кг ксилазина и помещали на лоток, покрытый свинцовым приспособлением толщиной 4 мм, обнажая только заднюю правую ногу примерно в 30 см от источника луча. Затем мышей облучали однократной дозой 15 Гр с использованием промышленного рентгеновского аппарата Philips (1,1 Гр/мин). Через 24 часа мышам внутрибрюшинно инъецировали 100 мкг блокирующих антител против CTLA-4 (клон 9D9, BioXCell) и PD-1 (RMP1-14, BioXCell). В некоторых экспериментах выход Т-клеток из лимфоидных органов блокировали у мышей с пальпируемыми опухолями с помощью ежедневных интраперитонеальных инъекций 1 мг/кг FTY720 (Sigma Aldrich) перед инъекцией анти-TRP1 плюс анти-CD40 и иммунотерапии TNFα.

Истощение постоянного тока

Для создания химерных мышей CD11c-DTR BM летально облученным (9 Гр с использованием γ-облучателя Biobeam7000, 137 Cs, 2,6 Гр/мин) мышам вводили внутривенно 5 × 10 6 клеток костного мозга и заражали 2,5 × 10 5 клеток B16F10. 3 недели спустя. Для истощения клеток CD11c + мышам внутрибрюшинно вводили 4 нг/г массы тела дифтерийного токсина (D0564; Sigma Aldrich) через 6 дней после заражения опухолью. Для истощения моноцитов мышам вводили 100 мкг анти-CCL2 (клон-2H5, BioLegend). Через 24 часа мышам вводили 1×10 6 селезеночных CD8 + T-клеток, экспрессирующих gp100-реактивный TCR, и 300000 МЕ IL2, вводили внутрибрюшинно ежедневно.

Инкорпорация In vivo или BrdU

Мышам с зараженной опухолью каждый день внутрибрюшинно вводили 1 мг 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU) в 200 мкл PBS. В несколько моментов времени мышей подвергали эвтаназии и готовили одноклеточные суспензии из опухолей и дренирующих лимфатических узлов. Затем клетки окрашивали на маркеры клонов с последующим внутриклеточным окрашиванием FITC-конъюгированным антителом против BrdU в соответствии с инструкциями производителя (BD Pharmingen) и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Фотоактивация in vivo

Мышам PA (фотоактивированные)-GFP и mito-Dendra2 подкожно вводили 2 × 10 5 клеток B16F10 над правым и левым боками и позволяли расти в течение 8 дней. Опухоли освещали в течение 5 минут с длиной волны 405 нм с использованием светодиодного диода мощностью 20 мВт, изготовленного по заказу Thorlabs Inc. Через 24 часа выделяли ДК из крови, лимфатических узлов, селезенки и опухоли и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Иммуногистохимия

Для замороженных срезов, подготовленных, как описано ( 32 ). Для антимышиного окрашивания использовались антитела MHCII (клон M5/114.15.2), CD11c (клон N418), CD11b (клон M1/70) и анти-TCRβ (H57-597), все от BioLegend. Использовали расщепленную каспазу-3 (клон 5A1E) от Cell Signaling Technologies и LYVE-1 (клон ALY7) от Invitrogen. Ядра контрастировали Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific). Для античеловеческого окрашивания использовали антитела HLA-DR (клон L243) и CD11c (клон 3.9), оба от BioLegend.

Конфокальная микроскопия

B16-Wasabi, CD8 + T-клетки и CD11b + DC совместно культивировали на конфокальных планшетах со стеклянным дном (Cellvis) в среде T-клеток без IL2 и инкубировали в течение ночи в стандартных условиях. Для функциональных анализов DC инкубировали в течение 30 минут с разбавленными 1:50 латексными шариками, меченными FITC (Sigma Aldrich). Клетки DC окрашивали LysoSensor (L7533, Thermo Fisher Scientific). Для визуализации переноса лизосом клетки B16F10 окрашивали лизотрекером (L7526, Thermo Fisher Scientific) в течение 30 минут при 37°C и дважды промывали перед добавлением 50×10 4 MoDC. Изображения были собраны с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM800 и проанализированы с использованием программного обеспечения ZEN (Carl Zeiss Microscopy).

Тест на уничтожение in vitro

CD8 + T-клетки человека, MoDC и опухолевые клетки были выделены из образца ткани меланомы человека, а также CD8 + T-клетки из PB. Мышиные CD8 + Т-клетки выделяли из различных органов мышей с опухолями. CD8 + Т-клетки культивировали совместно с опухолевыми клетками (10 000 клеток на лунку) с CD11b + или без него.DC в соотношении 1:5:2 (T:E:DC) в круглодонном 96-луночном планшете. Через 24 часа клетки инкубировали в течение 1 часа с биотин-конъюгированным анти-CD107a (BioLegend) в разведении 1:100. Клетки дополнительно окрашивали (BV421)-стрептавидином, (Alexa Fluor 488)-CD45, (Brilliant Violet 605)-CD8 и аннексином V в течение 15 минут и в течение 2 минут раствором йодистого пропидия (PI) (все от Biolegend) на льду, и уровни окрашивания анализировали с помощью проточной цитометрии (CytoFLEX, Beckman Coulter).

Выделение экзосом и лизосом

Для выделения лизосом, секретируемых опухолью, клеточные линии B16F10, TRP1-GFP-экспрессирующие B16F10, Melan-A и A375 культивировали в течение 48 часов, а затем DMEM с добавлением 10% термоинактивированного FBS центрифугировали при 140 000 об/мин в течение 1 часа для истощения бычьего — производные экзосомы. Для выделения лизосом, происходящих из Т-клеток, 2 × 10 7 CD8 + T-клеток выделяли из селезенки или PB и высевали на 10-см планшет, предварительно покрытый анти-CD3-антителами, на 48 часов. Супернатанты собирали и концентрировали с использованием ультрацентрифуги Optima XPN при 140000 об/мин в течение 1 часа, а осадок, содержащий либо экзосомы, либо лизосомы, ресуспендировали в 50 мкл PBS.

Экзосомы СЭМ-визуализация

Изолированные меланосомы B16F10 и Melan A адсорбировали на сетках, покрытых формваром/углеродом, и окрашивали 2% водным раствором уранилацетата. Образцы исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии JEM 1400plus.

Интенсивность люминесценции каспазы-3/7

CD11b + DC, выделенные из опухоли, дренирующего лимфатического узла (DLN) или PB, культивировали в 96 лунках (10 000 клеток на лунку) в полной среде DMEM с добавлением 50 нг/мл GMCSF. Для апоптотической активности PB CD11b +ДК предварительно обрабатывали в течение 1 часа 25 мкмоль/л ингибитора каспазы-1 VX-765 (CAS 273404-37-8, Santa Cruz Biotechnology) или 20 мкмоль/л ингибитора каспазы-3 (Z-VAD(OMe)-FMK, CAS 187389-52-2, Santa Cruz Biotechnology) и инкубировали с: 50 мг/мл синтетического меланина в ДМСО (M0418, Sigma Aldrich) или с необработанными, денатурированными нагреванием (56°C, 1 час) экзосомами B16F10 или с лизосомами. истощенные (биотин-анти-LAMP-1 и стрептавидин-магнитные шарики; MojoSort Nanobeads, BioLegend). Клетки визуализировали с помощью конфокального микроскопа или анализировали на активность каспазы с использованием анализа Caspase-Glo 3/7 (Promega) в планшет-ридере Synergy H1M (BioTek).

Проточной цитометрии

Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии (CytoFLEX, Beckman Coulter) и сортировали с помощью FACS (BD FACSAria III, BD Biosciences). Наборы данных были проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star). Использовали следующие мышиные антигены: (Brilliant Violet 421)-CD45 (клон 30-F11), (Alexa Fluor 647)-MHCII (клон M5/114.15.2), (Alexa Fluor 594, Brilliant Violet 605)-CD11c (клон N418), (Per-CP)-CD11b (клон M1/70), (Alexa Fluor 488)-CD86 (клон GL-1), (PE-Cy7)-CD103 (клон 2E7), (APC-Cy7)-Ly6C ( клон HK1.4), (Brilliant Violet 421)-βTCR (клон), (PE)-CD4 (клон RM4-4), (Brilliant Violet 605)-CD8 (клон 53-6.7), (Alexa Fluor 488)-CD45 (клон 30-F11), (APC)-NKp46 (клон 29AI.4), (PE/Cy7)-CD19 (клон 6D5), (PE)-B220 (клон RA3-6B2), (Alexa Fluor 488)-CCR7 (клон 4B12) и (PE)-MERTK (клон 2B10C42).

Для антигенов, специфичных для человека, использовали следующие антитела: (Alexa Fluor 488) CD3 (HIT3a), (Alexa Fluor 594) CD4 (RPA-T4), (Аллофикоцианин) CD19 (HIB19), (Alexa Fluor 647) CD8 (HIT8a). ), (Brilliant Violet 650) CD11c (3,9), (Alexa Fluor 647) CD16 (3G8), (PerCp/Cy5.5) CD32 (FUN-2), (Brilliant Violet 421) CD64 (10,1), (Allophycocyanin/Cy7 ) CD45RO (UCHL1) и (фикоэритрин/Cy7) CD45RA (HI100). Все Ab были приобретены у BioLegend. Клетки суспендировали в буфере FACS, состоящем из HBSS с 2% FCS и 0,05 ммоль/л ЭДТА.

Генный анализ больных меланомой

Обратите внимание, что 474 профиля экспрессии меланомы из набора данных секвенирования РНК The Cancer Genome Atlas (TCGA) были загружены с веб-сайта UCSC XENA ( http://xena.ucsc.edu/ ) вместе с соответствующей клинической информацией. Мы использовали программный пакет PROMO для импорта, предварительной обработки, анализа и визуализации данных ( http://acgt.cs.tau.ac.il/promo/). Шесть несовместимых образцов были удалены на основании их меток фенотипа. Алгоритм кластеризации k-средних был применен к нормализованным уровням экспрессии 16 дендритных генов, чтобы разделить 468 оставшихся образцов меланомы на четыре группы образцов. Четыре группы образцов характеризуются различными уровнями сигнатуры дендритной экспрессии. Анализ выживаемости с использованием графика Каплана-Мейера и логарифмического рангового критерия показал, что четыре кластера представляют разные риски для 5-летнего выживания.

Графики Каплана-Мейера пациентов с меланомой на основе экспрессии CD1c ( https://www.proteinatlas.org/ENSG00000158481-CD1C/pathology/melanoma ) и CD11c ( https://www.proteinatlas.org/ENSG00000140678-ITGAX/pathology ). /melanoma ) рассчитывали по данным репозитория Human Protein Atlas ( http://www.proteinatlas.org ).

Статистический анализ

Каждый эксперимент проводили 3 раза. Каждая экспериментальная группа состояла не менее чем из 3 мышей. Для временных экспериментов значимость рассчитывалась с использованием непараметрического двустороннего дисперсионного анализа с поправкой Тьюки для нескольких гипотез. В некоторых случаях апостериорный тест Бонферрони-Сидака выполнялся после двустороннего дисперсионного анализа. Для анализа двух групп был выполнен однофакторный дисперсионный анализ с критерием Данна. Результаты анализировали с помощью Prism (программное обеспечение GraphPad). Все статистические анализы были выполнены в Prism (GraphPad Software, Inc.).

Утверждение исследования

Все мыши были размещены в помещении для животных, аккредитованном Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными, и содержались в особых условиях отсутствия патогенов. Эксперименты на животных были одобрены и проводились в соответствии с аккредитацией лабораторий Тель-Авивского университета (01-17-067 и 01-19-034). Институциональный наблюдательный совет Тель-Авивского университета и совет Медицинского центра Рабина-Бейлинсон одобрили протоколы субъектов (этическое одобрение Хельсинки 0326-18), и до участия в исследовании от всех субъектов было получено информированное согласие.

Полученные результаты

Иммунотерапия не может уничтожить опухоль меланомы на поздних стадиях

Первоначально мы стремились определить точный момент времени, когда иммунотерапия теряет свою терапевтическую эффективность. С этой целью мы инъецировали мышам C57BL/6 подкожно клетки B16F10 и позволяли им расти до тех пор, пока они не достигали ощутимого размера. В несколько моментов времени мы инъецировали мышам внутриопухолево комбинацию TNFα + анти-CD40 и антитела против антигена меланомы TRP1, которые показали высокую эффективность в опухолях мышей ( 25, 34 ). У мышей, которых лечили до десятого дня, отмечалась значительная регрессия опухоли. Это лечение было все еще эффективным, когда опухоли лечили на 12-й день, хотя и менее эффективным по сравнению с более ранними днями. Напротив, это лечение не влияло на размер опухоли, когда опухоли лечили на 14-й день или позже ( рис. 1А ).). Аналогичные результаты были также получены с использованием клеточной линии, выделенной из трансгенных мышей ret. Инъекция TNFα + анти-CD40 и анти-TRP1 антитела мышам с опухолями менее 20 мм 2 вызывала значительную регрессию опухоли, тогда как лечение мышей с большими опухолями было почти инертным ( фиг. 1B ). Важно отметить, что увеличение дозы проводимой иммунотерапии не улучшало реактивность опухолей на поздних стадиях (дополнительные рис. S1A и S1B).Фигура 1.

Иммунотерапия не способна уничтожить опухоль меланомы на поздних стадиях. A — размер опухоли у мышей, которым подкожно вводили клетки B16F10 и которых лечили антителами против TRP1 + CD40L и TNFα ( n = 4). B, размер опухоли у мышей, которым вводили клетки меланомы ret и внутриопухолево лечили анти-TRP1 + анти-CD40 и TNFα ( n = 3). C, размер опухоли у мышей, которым вводили клетки B16F10 и ежедневно обрабатывали CpG и PolyI:C. D — размер опухоли у мышей, которым инъецировали клетки B16F10, локально облучали дозой 15 Гр и лечили анти-CTLA-4 и анти-PD-1. E, Иллюстрация экспериментального дизайна. Эта фигура была создана с помощью BioRender ( https://biorender.com/). F, размер опухоли у мышей, которым подкожно вводили клетки B16F10 и которых лечили gp100-реактивными CD8 + T-клетками и высокими дозами IL2 ( n = 4). Показан один репрезентативный эксперимент из не менее трех проведенных. Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений. **, р < 0,01; ****, Р < 0,0001.

Затем мы проверили, характерно ли это для других видов иммунотерапии или, скорее, ограничивается этим конкретным лечением. Мышам с опухолями B16F10 вводили агонисты TLR9 и TLR7. Опять же, эффективность лечения была почти полностью аннулирована однажды при опухолях на поздних стадиях ( рис. 1C ). Увеличение вводимой дозы не привело к регрессии опухоли на поздних стадиях (дополнительная рис. S1C). Недавно Твайман-Сент-Виктор и его коллеги разработали протокол, сочетающий высокие дозы облучения и блокаду контрольно-пропускных пунктов ( 33 ). Инъекция антител против PD-1 и CTLA-4 с последующим локальным облучением опухоли вызывала значительную регрессию опухоли в небольших опухолях, но не в опухолях на поздних стадиях ( рис. 1D ).

Затем мы проверили, может ли адоптивный перенос опухоле-реактивных Т-клеток вызывать регрессию опухолей на поздних стадиях. С этой целью CD8 + Т-клетки селезенки, инфицированные TCR против антигена меланомы gp100, вводили вместе с высокими дозами IL2 сублетально облученным мышам с опухолями в соответствии с установленным протоколом ( фиг. 1E ; ссылка 26 ). Аналогичным образом, инъекция gp100-реактивных Т-клеток вызывала заметную регрессию опухолей на ранней стадии, но была почти инертной при введении мышам с опухолями на поздней стадии ( рис. 1F ).

Распространенность опухолеинфильтрирующих ДК снижается при прогрессировании меланомы.

Мы охарактеризовали изменения в составе субпопуляций иммунных клеток от ранних до поздних стадий опухолей меланомы. Мы обнаружили резкое снижение с течением времени количества и процента общего количества лейкоцитов, инфильтрирующих опухоли B16F10 и меланомы ret ( рис. 2A — C ). Это снижение было обнаружено почти во всех популяциях иммунных клеток, но в основном в клетках естественных киллеров (NK), Т-клетках и DC (дополнительная рис. S2A – S2B). Это снижение было ограничено опухолями и не наблюдалось в крови или DLN (дополнительные рисунки S2C и S2D). Хотя ожидается, что снижение количества NK и CD8 + T-клеток в опухолях на поздних стадиях коррелирует со снижением лизиса опухоли, неясно, почему снижение инфильтрирующих опухоль DC влияет на эффективность иммунотерапии.Фигура 2.

Рисунок 2. Распространенность инфильтрирующих опухоль ДК снижается по мере прогрессирования меланомы.  A, средний процент клеток CD45+, инфильтрирующих опухоли B16F10 (n = 3).  B, среднее количество клеток CD45+ в опухолях B16F10 (n = 3).  C, репрезентативное окрашивание CD45 в гистологических срезах B16F10 из опухолей на ранней (6-й день) и поздней стадии (14-й день).  D, среднее количество клеток CD103+ DC и MoDC-инфильтрирующих опухолей B16F10 с течением времени (n = 3).  E, типичный проточный цитометрический анализ инфильтрирующих опухоль DC в опухолях B16F10 на ранней стадии (день 6) и поздней стадии (день 14).  F, гистологическое окрашивание инфильтрирующих опухоль DC в опухолях B16F10 на ранней стадии (день 8) и поздней стадии (день 14; x200).  G, конфокальные изображения CD11b+ DC, выделенных из опухолей, и DLN мышей, зараженных васаби-меченым B16F10.  ЧАС,  Размер опухоли B16F10 после инъекции анти-TRP1+ анти-CD40 и TNFα и ежедневной инъекции FTY720 (n = 4).  Показан один эксперимент из не менее трех проведенных.  Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений.  *, р < 0,05;  **, р < 0,01;  ****, Р < 0,0001.

Распространенность опухолеинфильтрирующих ДК снижается по мере прогрессирования меланомы. A, средний процент клеток CD45 + , инфильтрирующих опухоли B16F10 ( n = 3). B, среднее количество клеток CD45 + в опухолях B16F10 ( n = 3). C, репрезентативное окрашивание CD45 в гистологических срезах B16F10 из опухолей на ранней (6-й день) и поздней стадии (14-й день). D, среднее количество клеток CD103 + DC и MoDC-инфильтрирующих опухолей B16F10 с течением времени ( n = 3). E, типичный проточный цитометрический анализ инфильтрирующих опухоль DC в опухолях B16F10 на ранней стадии (день 6) и поздней стадии (день 14). Ф,Гистологическое окрашивание инфильтрирующих опухоль DC в опухолях B16F10 на ранней стадии (8-й день) и поздней стадии (14-й день; x200). G, конфокальные изображения CD11b + DC, выделенных из опухолей, и DLN мышей, зараженных васаби-меченым B16F10. H, размер опухоли B16F10 после инъекции анти-TRP1+ анти-CD40 и TNFα и ежедневной инъекции FTY720 ( n = 4). Показан один эксперимент из не менее трех проведенных. Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений. *, р < 0,05; **, р < 0,01; ****, Р < 0,0001.

Поэтому мы изначально задались целью понять, почему DC уменьшаются со временем. Было обнаружено, что инфильтрирующие опухоль DC (TIDC) состоят из MoDC и мигрирующих CD103 + DC (дополнительная рис. S2E). Оба подмножества DC присутствовали в опухолях на ранней стадии, но почти полностью отсутствовали в опухолях на поздних стадиях, когда иммунотерапия неэффективна ( рис. 2D и E ; дополнительная рис. S2F). Хотя считается, что CD103 + DC являются лучшими антигенпрезентирующими клетками, более 90% TIDC представляют собой MoDC, что дает основание для дальнейшего выяснения их влияния на эффективность иммунотерапии. Резкое снижение количества MoDC в опухолях на поздних стадиях было дополнительно визуализировано на срезах тканей опухолей меланомы мыши. Срезы опухолей восьмого дня были сильно инфильтрированы CD11b.+ MoDC, тогда как срезы с 14-го дня содержали лишь незначительное количество MoDC ( рис. 2F ).

Общее мнение предполагает, что после поглощения опухолевого антигена MoDC мигрирует в DLN, чтобы активировать Т-клетки. Было обнаружено, что MoDC, выделенные из меченных васаби опухолей, содержат опухолевые антигены ( рис. 2G ), а гистологические срезы этих опухолей показали, что они в основном локализованы в зоне Т-клеток в DLN (дополнительная рис. S2G). Соответственно, количество Т-клеток в DLN продолжало пролиферировать на протяжении всей прогрессии опухоли (дополнительная рис. S2H), а блокирование выхода Т-клеток из лимфоидных органов с помощью аналога сфингозина FTY720 почти полностью отменяет терапевтический эффект иммунотерапии ( рис. 2H ). Эти результаты предполагают, что DLN является основным местом презентации антигена и основным источником опухоле-реактивных Т-клеток.

Опухолеинфильтрирующие ДК не мигрируют в сторожевые лимфатические узлы.

Интересно, что мы не наблюдали значительного увеличения процентного содержания и количества MoDC в DLN или в крови во время прогрессирования опухоли ( рис. 3A и B ; дополнительная рис. S3A-S3C). Кроме того, все опухолевые лимфатические сосуды располагаются на периферии опухоли, при этом лимфатические сосуды не проникают в центр опухолей, где сосредоточено большинство МоДК. Все ДК, примыкающие к лимфатическим сосудам или находящиеся внутри них, экспрессируют низкие уровни CD11c и Ly6C, что позволяет предположить, что они представляют собой дермальные ДК или клетки Лангерганса, а не MoDC ( рис. 3С ).). Мы также могли обнаружить секретируемые опухолевые антигены, такие как TRP1, в MoDC, обнаруженном в DLN, что позволяет предположить, что опухолевые антигены могут пассивно дренироваться (дополнительные рис. S3D и S3E). Кроме того, MoDC не экспрессировали обнаруживаемые уровни CCR7, что необходимо для их миграции в DLN ( рис. 3D ).Рисунок 3.

Рис. 3. Опухолеинфильтрирующие ДК не мигрируют в сторожевые лимфатические узлы.  A, средний процент pan DC у мышей с опухолями B16F10 (n = 3).  B, FACS-анализ DC у мышей с опухолями B16F10 на ранней стадии (6-й день) и поздней стадии (14-й день; n = 3).  C, гистологическое окрашивание DC и лимфатических сосудов в меченном TRP1-GFP B16F10 в опухолях на 8-й день (× 200).  D, экспрессия CCR7 на DC из опухолей B16F10 на 8-й день.  E, Иллюстрация схемы эксперимента.  Эта фигура была создана с помощью BioRender (https://biorender.com/).  F, средний процент экспрессирующих Dendra2 MoDC из клеток CD11b+/CD11c+/MHCII+ у мышей с опухолями на 8-й день.  G, FACS-анализ экспрессии красного Dendra2.  H, конфокальные изображения клеток CD11b+ от мышей PA-GFP, несущих опухоль B16F10, через 24 часа после освещения опухоли.  I, слева, средний процент опухолевых MoDC, экспрессирующих PA-GFP.  Верно,  репрезентативный анализ FACS экспрессии PA-GFP в MoDC.  Показан один эксперимент из не менее трех проведенных.  Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений.  *, р < 0,05;  ****, Р < 0,0001.

Опухолеинфильтрирующие ДК не мигрируют в сторожевые лимфатические узлы. A, средний процент pan DC у мышей с опухолями B16F10 ( n = 3). B, FACS-анализ DC у мышей с опухолями B16F10 на ранней стадии (6-й день) и поздней стадии (14-й день; n = 3). C, гистологическое окрашивание DC и лимфатических сосудов в меченном TRP1-GFP B16F10 в опухолях на 8-й день (× 200). D, экспрессия CCR7 на DC из опухолей B16F10 на 8-й день. E, Иллюстрация схемы эксперимента. Эта фигура была создана с помощью BioRender ( https://biorender.com/ ). F, средний процент экспрессирующих Dendra2 MoDC от CD11b + /CD11c +/MHCII + клетки у мышей с опухолями на 8-й день. G, FACS-анализ экспрессии красного Dendra2. H, конфокальные изображения клеток CD11b + от мышей PA-GFP с опухолью B16F10 через 24 часа после освещения опухоли. I, слева, средний процент опухолевых MoDC, экспрессирующих PA-GFP. Справа репрезентативный анализ FACS экспрессии PA-GFP в MoDC. Показан один эксперимент из не менее трех проведенных. Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений. *, р < 0,05; ****, Р < 0,0001.

Чтобы отслеживать характер миграции MoDC, мы использовали мышей, экспрессирующих фотоконвертируемый флуоресцентный белок Dendra2, превращающийся в красный цвет. Мышам подкожно инъецировали клетки B16F10 и позволяли опухолям расти в течение 8 дней. Затем мы провели небольшую операцию на коже, прилегающей к опухоли, и опухоль освещали с помощью светодиодной матрицы с длиной волны 405 нм ( рис. 3Е ). Через 24 часа кровь, селезенку, опухоль, правый паховый DLN и левый подмышечный не-DLN удаляли, а зелено-красное преобразование MoDC анализировали с помощью проточной цитометрии. Мы не смогли обнаружить MoDC, экспрессирующий красный флуоресцентный белок, ни в одном из тестируемых органов, но в опухолях ( рис. 3F и G ).). Напротив, В-клетки, NKT-клетки и нейтрофилы, экспрессирующие красный флуоресцентный белок, были обнаружены в крови и лимфоидных тканях по всему телу (дополнительная рис. S3F). Одним из предостережений в отношении этого метода является относительно быстрое затухание сигнала красной флуоресценции, поскольку сразу после освещения около 80% иммунных клеток выражали красную флуоресценцию, тогда как через 24 часа около 40% оставались положительными (дополнительный рисунок S3G). Поэтому мы также использовали мышей, экспрессирующих фотоактивируемый белок GFP (PA-GFP), который более стабилен по сравнению с Dendra2, но имеет гораздо меньшую интенсивность флуоресценции. Мы могли обнаружить CD103 + DC и моноциты, но не в зрелых MoDC, экспрессирующих PA-GFP в DLN мышей с опухолями ( фиг. 3H и I ).

Инфильтрирующие опухоль ДК подвергаются опосредованной инфламмасомами гибели клеток из-за поглощения лизосом, секретируемых опухолью.

При выделении MoDC из опухолей мы заметили, что MoDC из опухолей поздних стадий, но не из опухолей ранних стадий, демонстрируют быструю гибель клеток при культивировании in vitro ( рис. 4A ). Анализ активности каспазы-3/7 показал, что эти клетки подвергаются апоптозу ( фиг. 4В ). Напротив, MoDC, выделенные из DLN и крови мышей с опухолями на поздних стадиях, были жизнеспособны и сравнимы с MoDC из опухолей на ранних стадиях и интактных мышей ( рис. 4A и B ).). Хотя MoDC из опухолей поздней стадии полностью утратили способность фагоцитировать латексные шарики, фагоцитарная способность MoDC из опухолей ранней стадии была сравнима с таковой у наивных мышей (дополнительная рис. S4A). Соответственно, более высокие уровни расщепленной каспазы-3 наблюдались в гистологических срезах опухолей на поздних стадиях по сравнению со срезами на ранних стадиях ( фиг. 4C ).Рисунок 4.

Рисунок 4. Опухоль-инфильтрирующие DC претерпевают гибель клеток из-за поглощения лизосом, секретируемых опухолью.  A, конфокальная микроскопия CD11b+ DC, отсортированных от мышей с опухолями на ранней стадии (8-й день) и поздней стадии (14-й день; ×400).  B, активность каспазы-3/7 в ДК мышей с опухолями на ранней стадии (день 8) и поздней стадии (день 14).  C, гистологическое окрашивание расщепленной каспазы-3 в опухолях на ранней (8-й день) и поздней стадии (14-й день) (×200).  D, Протокол выделения меланоцитов и экзосом, полученных из меланомы.  E, конфокальная микроскопия MoDC мышей с опухолями, инкубированных в течение ночи с экзосомами (×400).  F и G, график (F) и конфокальная микроскопия (G) активности каспазы-3/7 в MoDC, обработанных экзосомами B16F10 (n = 3).  H, конфокальная микроскопия MoDC, выделенных от мышей WT или NLRP3 KO, получавших экзосомы B16F10 или активированные лизосомы CD8+ T-клеток.  Я,  Активность каспазы-3/7 в MoDC, выделенном от мышей NLRP3 KO с экзосомами B16F10 или без них.  J, размер опухоли (мм2) у мышей, которым подкожно вводили клетки YUMM1.7 и внутриопухолево лечили антителами против TRP1 плюс CD40L и TNFα (n = 4).  Показан один эксперимент из не менее трех проведенных.  Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений.  **, р < 0,01;  ***, р < 0,001;  ****, Р < 0,0001.

Опухоль-инфильтрирующие ДК подвергаются гибели клеток из-за поглощения лизосом, секретируемых опухолью. A, конфокальная микроскопия CD11b + DC, отсортированных от мышей с опухолями на ранней стадии (8-й день) и поздней стадии (14-й день; × 400). B, активность каспазы-3/7 в ДК мышей с опухолями на ранней стадии (день 8) и поздней стадии (день 14). C, гистологическое окрашивание расщепленной каспазы-3 в опухолях на ранней (8-й день) и поздней стадии (14-й день) (×200). D, Протокол выделения меланоцитов и экзосом, полученных из меланомы. E, конфокальная микроскопия MoDC мышей с опухолями, инкубированных в течение ночи с экзосомами (×400). F и G, График ( F) и конфокальная микроскопия ( G ) активности каспазы-3/7 в MoDC, обработанном экзосомами B16F10 ( n = 3). H, конфокальная микроскопия MoDC, выделенных от мышей WT или NLRP3 KO, обработанных экзосомами B16F10 или активированными лизосомами CD8 + T-клеток. I, активность каспазы-3/7 в MoDC, выделенном от мышей NLRP3 KO с экзосомами B16F10 или без них. J, размер опухоли (мм 2 ) у мышей, которым подкожно вводили клетки YUMM1.7 и внутриопухолево лечили антителами против TRP1 плюс CD40L и TNFα ( n = 4). Показан один эксперимент из не менее трех проведенных. Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений. **,Р <0,01; ***, р < 0,001; ****, Р < 0,0001.

Мы также заметили, что большинство проникающих в опухоль MoDC, даже в опухолях на ранней стадии, содержат высокую плотность меланосом, что свидетельствует о поглощении экзосом (дополнительная рис. S4B). Поэтому мы выделили экзосомы из супернатантов клеток B16F10 и инкубировали их с MoDC из крови мышей-опухоленосителей. В качестве контроля мы использовали синтетический меланин или меланосомы, выделенные из иммортализованных меланоцитов ( рис. 4D ). Инкубация с экзосомами из B16F10, но не из нормальных меланоцитов или с меланином, индуцировала массивный апоптоз MoDC ( рис. 4E ).; Дополнительный рис. S4C). Индукция апоптоза экзосомами была ограничена MoDC, поскольку инкубация первичных кератиноцитов и Т-клеток селезенки с экзосомами, секретируемыми меланомой, не индуцировала их апоптоз (дополнительная рис. S4D). Анализ мутанома B16 показал, что ни один из ферментов, синтезирующих меланин, не мутирован в B16F10 ( 35 ).). Кроме того, исследование меланосом B16F10 под электронной микроскопией показало, что они не повреждены и похожи на меланосомы, секретируемые из нормальных меланоцитов (дополнительная рис. S4E), что позволяет предположить, что могут быть вовлечены другие экзосомы. Помимо меланосом, B16F10 также секретируют высокие уровни лизосом (дополнительная рис. S4F). Избирательная маркировка лизосом в B16F10 показала, что они эффективно поглощаются MoDC (дополнительная рис. S4G). Истощение лизосом из экзосом, полученных из меланомы, перед инкубацией с MoDC почти полностью предотвращало апоптоз ( рис. 4F и G ).

Денатурация секретируемых меланомой экзосом при 56°C в течение 30 минут перед их инкубацией с MoDC полностью блокировала их способность индуцировать апоптоз ( рис. 4F и G ). Инкубация MoDC с ингибитором панкаспазы или с VX-765, селективным ингибитором каспаз 1 и 4, значительно ингибировала апоптоз в этих клетках ( рис. 4F и G ; дополнительная рис. S4H). Соответственно, апоптоз, индуцированный лизосомами, был почти полностью отменен в MoDC, полученных от мышей, дефицитных по Nod-подобному рецепторному белку 3 (NLRP3 KO; Fig. 4H и I ). Лизосомы, выделенные из Т-клеток селезенки, индуцируют апоптоз в MoDC на уровнях, аналогичных тем, которые индуцируются лизосомами, секретируемыми меланомой.Рис. 4H ), предполагая, что это не является результатом особой особенности лизосом, происходящих от меланомы.

Затем мы проверили эффективность иммунотерапии при поздней стадии меланомы, не секретирующей лизосомы. Скрининговый анализ показал, что клетки меланомы YUMM1.7 ( 36 ) не секретируют лизосомы (дополнительная фигура S4H). Таким образом, мышей с большими опухолями лечили комбинацией антител против TNFα + анти-CD40 и анти-TRP1. Действительно, эти опухоли содержали жизнеспособные MoDC, и опухоли претерпевали регрессию после введения иммунотерапии ( фиг. 4J ).

Инфильтрирующие опухоль MoDC необходимы для лицензирования цитотоксической активности CD8 + T-клеток .

Затем мы рассмотрели, почему отсутствие проникающих в опухоль MoDC влияет на результаты иммунотерапии. Хотя DLN является основным участком, в котором генерируются опухоле-реактивные Т-клетки, инкубация CD8 + T-клеток, выделенных из крови, или DLN мышей с опухолью B16F10 с клетками B16F10 не приводила к высвобождению литических гранул и опухолевых клеток. лизис ( рис. 5А- С ) . Напротив, инкубация клеток B16F10 с инфильтрирующими опухоль CD8 + Т-клетками на восьмой день приводила к значительному лизису клеток B16F10 и секреции литических гранул из Т-клеток ( рис. 5A — C ).). Добавление MoDC, выделенного из опухоли, но не из крови или DLN мышей с опухолью, индуцировало высвобождение цитотоксических гранул из CD8 + T-клеток и лизис опухолевых клеток ( рис. 5D — F ). В соответствии с их потерей функции MoDC из опухолей на поздних стадиях не способствовали секреции литических гранул и лизису опухолевых клеток CD8 + T-клетками (дополнительная рис. S5A).Рисунок 5.

Рисунок 5. Инфильтрирующие опухоль MoDC необходимы для лицензирования цитотоксической активности CD8+ T-клеток.  А — конфокальная микроскопия Т-клеток CD8+, выделенных от мышей с опухолями и культивированных в течение ночи вместе с мечеными васаби клетками меланомы B16F10 (×200).  B, средний процент клеток меланомы B16F10, окрашенных для аннексина V/PI (n = 3).  C, средний процент связанного с мембраной CD107a в CD8+ T-клетках мышей с опухолями, культивируемых в течение ночи с клетками B16F10 (n = 3).  D, конфокальная микроскопия DC и CD8+ Т-клеток мышей с опухолями, инкубированных в течение ночи с клетками меланомы B16F10 (×200).  E, средний процент клеток меланомы B16F10, окрашенных аннексином V/PI, после инкубации в течение ночи с CD8+ T-клетками из DLN мышей с опухолями (n = 3).  F, средний процент связанного с мембраной CD107a в CD8+ Т-клетках из DLN мышей с опухолями (n = 3).  ГРАММ,  Средний процент клеток меланомы B16F10, окрашенных аннексином V/PI, после ночной инкубации с CD8+ Т-клетками мышей с опухолями (n = 3).  H, средний процент связанного с мембраной CD107a в DLN CD8+ T-клетках (n = 3).  I, средний процент связанного с мембраной CD107a в CD8+ T-клетках из DLN мышей с опухолями, культивируемых в течение ночи с DC в присутствии блокирующих антител к MHC-I (n = 3).  J, средний процент DC, экспрессирующих CD40+CD86+, у мышей с опухолями на 8-й день (n = 3).  K, экспрессия CD40+CD86+ на ДК от мышей с опухолями на 8-й день.  L, средний процент клеток меланомы B16F10, окрашенных аннексином V/PI, после инкубации в течение ночи с DC и CD8+ от мышей с опухолями (n = 3).  M, средний процент связанного с мембраной CD107a в CD8+ T-клетках из DLN мышей с опухолями, культивируемых в течение ночи с клетками DC и B16F10 (n = 3).  Показан один репрезентативный эксперимент из не менее трех проведенных.  Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений.  *, р < 0,05;  **, р < 0,01;  ***, р < 0,001;  ****, р < 0,0001;  нс, несущественно.

Инфильтрирующие опухоль MoDC необходимы для лицензирования цитотоксической активности CD8 + T-клеток. A, конфокальная микроскопия CD8 + Т-клеток, выделенных от мышей с опухолями и сокультивированных в течение ночи с мечеными васаби клетками меланомы B16F10 (×200). B, средний процент клеток меланомы B16F10, окрашенных для аннексина V/PI ( n = 3). C, средний процент связанного с мембраной CD107a в CD8 + Т-клетках мышей с опухолями, культивируемых в течение ночи с клетками B16F10 ( n = 3). D, конфокальная микроскопия DC и CD8 + T-клеток мышей с опухолями, инкубированных в течение ночи с клетками меланомы B16F10 (×200). Э,Средний процент клеток меланомы B16F10, окрашенных аннексином V/PI, после инкубации в течение ночи с CD8 + T-клетками из DLN мышей с опухолями ( n = 3). F, средний процент связанного с мембраной CD107a в CD8 + T-клетках из DLN мышей с опухолями ( n = 3). G, средний процент клеток меланомы B16F10, окрашенных аннексином V/PI, после инкубации в течение ночи с CD8 + Т-клетками мышей с опухолями ( n = 3). H, средний процент связанного с мембраной CD107a в DLN CD8 + T-клетках ( n = 3). я, Среднее процентное содержание мембраносвязанного CD107a в CD8 + T-клетках из DLN мышей с опухолями, культивируемых в течение ночи с DC в присутствии блокирующих антител к MHC-I ( n = 3). J, средний процент DC, экспрессирующих CD40 + CD86 + , у мышей с опухолями на 8-й день ( n = 3). K, экспрессия CD40 + CD86 + на DC от мышей с опухолями на 8-й день. L, средний процент клеток меланомы B16F10, окрашенных аннексином V/PI, после инкубации в течение ночи с DC и CD8 + от мышей с опухолями ( n = 3). М,Средние проценты мембраносвязанного CD107a в CD8 + T-клетках из DLN мышей с опухолями, культивируемых в течение ночи с клетками DC и B16F10 ( n = 3). Показан один репрезентативный эксперимент из не менее трех проведенных. Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений. *, р < 0,05; **, р < 0,01; ***, р < 0,001; ****, р < 0,0001; нс, несущественно.

Затем мы проверили, секретируются ли сигналы, которые индуцируют активацию CD8 + T-клеток, MoDC или, скорее, зависят от клеточного контакта. Таким образом, CD8 + Т-клетки из DLN мышей с опухолями инкубировали с клетками B16F10 в присутствии выделенных ДК или с их супернатантами. Значительный лизис опухолевых клеток и секреция литических гранул по сравнению с исходными уровнями наблюдались только при добавлении инфильтрирующих опухоль MoDC, но не их супернатантов, что указывает на то, что для активации Т-клеток требуется контакт с клетками ( рис. 5G и H ; дополнительные данные; рис. 5B ). ). Активация CD8 + Т-клеток не снижалась при блокировании взаимодействий MHCI-TCR ( фиг. 5I ).

Поскольку MoDC экспрессируют более высокие уровни CD86 и CD40 ( фиг. 5J и K ), мы проверили, достаточно ли стимуляции MoDC классическими адъювантами для активации CD8 + Т-клеток. Таким образом, PB MoDC выделяли и активировали с помощью LPS или ant-CD40 и добавляли к совместной культуре CD8 + T-клеток и опухолевых клеток. Подобно MoDC из опухолей, стимулированные MoDC крови активировали CD8 + T-клетки, чтобы секретировать литические гранулы и уничтожать опухолевые клетки ( фиг. 5L и M ).

Инфильтрирующие опухоль MoDC необходимы для CD8 + Т-клеточной иммунотерапии .

Чтобы проверить, действительно ли опухолевые MoDC необходимы для Т-клеточного иммунитета, мы создали химерных мышей CD11c-DTR BM и заразили их клетками B16F10. Как только опухоль достигала ощутимого размера, мышам вводили дифтерийный токсин для системного истощения ДК с последующим адоптивным переносом gp100-реактивных Т-клеток. Хотя введение Т-клеток контрольным мышам с опухолями индуцировало регрессию опухоли, их введение мышам, истощенным ДК, было почти инертным ( рис. 6А ).). Поскольку истощение CD11c не ограничивается MoDC, мы затем проверили, повлияет ли блокирование миграции моноцитов на иммунотерапию Т-клетками. Мышей с пальпируемыми опухолями B16F10 лечили антителами против CCL2 с последующим адоптивным переносом gp100-реактивных Т-клеток или внутриопухолевыми инъекциями антител TNFα+анти-CD40 и анти-TRP1. В обоих экспериментах блокирование миграции моноцитов значительно снижало эффективность проводимой иммунотерапии ( фиг. 6B и C ).Рисунок 6.

Рисунок 6. Инфильтрирующие опухоль MoDC необходимы для иммунотерапии CD8+ T-клетками.  A, размер опухоли B16F10 у мышей, получавших адоптивный перенос gp100-реактивных CD8+ Т-клеток, в химерных мышах CD11c-DTR BM, предварительно инъецированных PBS или дифтерийным токсином (n = 5).  B, размер опухоли B16F10 у мышей, получавших адоптивный перенос gp100-реактивных CD8+ T-клеток и антител против CCL2 (n = 4).  C, размер опухоли B16F10 у мышей, получавших антитела к TRP1 + антитела к CD40 и TNFα и антитела к CCL2 (n = 4).  D, изображения конфокальной микроскопии MoDC опухоли, выделенной из необработанных опухолей на поздних стадиях или из опухолей, обработанных GMCSF и анти-CD40 (×400).  E, средний процент опухолевых CD45+, Pan DC и MoDC после лечения адоптивным переносом CD8+ Т-клеток и анти-CD40 на поздней стадии.  Ф,  Размер опухоли B16F10 у мышей, получавших адоптивный перенос gp100-реактивных CD8+ Т-клеток отдельно или с агонистическими анти-CD40 и GMCSF (n = 4).  Показан один репрезентативный эксперимент из не менее трех проведенных.  Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений.  *, р < 0,05;  **, р < 0,01;  ****, Р < 0,0001.

Инфильтрирующие опухоль MoDC необходимы для CD8 + Т-клеточной иммунотерапии. A, размер опухоли B16F10 у мышей, получавших адоптивный перенос gp100-реактивных CD8 + Т-клеток, в химерных мышах CD11c-DTR BM, предварительно инъецированных PBS или дифтерийным токсином ( n = 5). B, размер опухоли B16F10 у мышей, получавших адоптивный перенос gp100-реактивных CD8 + T-клеток и антител против CCL2 ( n = 4). C, размер опухоли B16F10 у мышей, получавших антитела к TRP1 + антитела к CD40 и TNFα и антитела к CCL2 ( n = 4). Д,Изображения конфокальной микроскопии MoDC опухоли, выделенной из необработанных опухолей поздних стадий или из опухолей, обработанных GMCSF и анти-CD40 (×400). E, средние проценты опухолевых CD45 + , Pan DC и MoDC после лечения адоптивным переносом CD8 + T-клеток и анти-CD40 на поздней стадии. F, размер опухоли B16F10 у мышей, которых лечили адоптивным переносом gp100-реактивных CD8 + T-клеток отдельно или агонистическими анти-CD40 и GMCSF ( n = 4). Показан один репрезентативный эксперимент из не менее трех проведенных. Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений. *, р < 0,05; **, р < 0,01; ****,Р <0,0001.

Мы также проверили, улучшит ли повышение жизнеспособности и активности MoDC в опухолях поздних стадий эффективность опухоле-реактивных CD8 + T-клеток. Мышам инъецировали B16F10, и опухолям давали возможность расти в течение по меньшей мере 10 дней, пока они не достигли среднего размера 50 мм 2 , после чего адоптивный перенос CD8 + Т-клеток перестал быть эффективным. Затем мышей лечили gp100-реактивными CD8 + T-клетками отдельно или в комбинации с анти-CD40 и GMCSF, которые, как мы обнаружили, увеличивали количество MoDC и жизнеспособность в опухолях ( фиг. 6D и E ). Эффект CD8 +Т-клетки отдельно или в сочетании с GMCSF были доброкачественными и не снижали опухолевой массы. Напротив, инъекция Т-клеток в сочетании с анти-CD40, с GMCSF или без него, вызывала значительную регрессию опухоли ( фиг. 6F ).

Меланомы человека индуцируют апоптоз MoDC и коррелируют с плохими клиническими исходами.

Затем мы попытались определить, применимы ли эти результаты к пациентам с меланомой человека. Первоначально мы оценили, коррелирует ли сигнатура экспрессии гена активированного MoDC с улучшенной выживаемостью пациентов с меланомой. Мы провели неконтролируемый анализ профилей экспрессии генов образцов 468 пациентов с меланомой, полученных из репозитория TCGA ( 37 ), с использованием программного инструмента PROMO ( http://acgt.cs.tau.ac.il/promo/ ). Профили пациентов были сгруппированы в четыре группы на основе уровней экспрессии 16 генов, связанных с активированным MoDC ( фиг. 7А ). График Каплана-Мейера для этих четырех групп показал прямую корреляцию между активированным MoDC и улучшенной выживаемостью ( рис. 7B ).). Хотя генная сигнатура активированного MoDC может коррелировать с другими иммунными субпопуляциями, этот анализ подчеркивает их распространенность в качестве прогностического прогностического маркера. Кроме того, анализ набора данных пациентов с меланомой из репозитория Human Protein Atlas показал, что белки, преимущественно экспрессируемые на миелоидных DC, коррелируют с улучшением выживаемости пациентов с меланомой (дополнительные рисунки S6A и S6B).Рисунок 7.

Рисунок 7. Меланомы человека вызывают гибель клеток MoDC и коррелируют с плохими клиническими исходами.  А. Анализ тепловой карты пациентов с меланомой на основе их профиля экспрессии 16 генов, указывающих на активированный MoDC.  B, график вероятности выживания Каплана-Мейера пациентов с меланомой, сгруппированных по профилю экспрессии активированных генов MoDC.  C, окрашивание аннексином V/PI опухолевых клеток, выделенных у пациентов с меланомой и инкубированных в течение ночи с аутологичными Т-клетками и проникающими в опухоль MoDC.  D, изображения конфокальной микроскопии опухолевых клеток, выделенных у пациентов с меланомой, инкубированных в течение ночи с аутологичными Т-клетками PB и с аутологичными инфильтрирующими опухоль MoDC (×200).  E, гистологическое окрашивание расщепленной каспазы-3 у резистентного к PD-1 пациента с меланомой.  Ф и Г,  Изображения конфокальной микроскопии (F) и активность каспазы-3/7 (G) MoDC человека от здорового донора, инкубированного с экзосомами, выделенными из клеток меланомы человека A375.  Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений.  **, р < 0,01;  ***, р < 0,001.

Меланомы человека вызывают гибель клеток MoDC и коррелируют с плохими клиническими исходами. А. Анализ тепловой карты пациентов с меланомой на основе их профиля экспрессии 16 генов, указывающих на активированный MoDC. B, график вероятности выживания Каплана-Мейера пациентов с меланомой, сгруппированных по профилю экспрессии активированных генов MoDC. C, окрашивание аннексином V/PI опухолевых клеток, выделенных у пациентов с меланомой и инкубированных в течение ночи с аутологичными Т-клетками и проникающими в опухоль MoDC. D, изображения конфокальной микроскопии опухолевых клеток, выделенных у пациентов с меланомой, инкубированных в течение ночи с аутологичными Т-клетками PB и с аутологичными инфильтрирующими опухоль MoDC (×200). Э,Гистологическое окрашивание расщепленной каспазы-3 у резистентного к PD-1 пациента с меланомой. F и G, изображения конфокальной микроскопии ( F ) и активность каспазы-3/7 ( G ) MoDC человека от здорового донора, инкубированного с экзосомами, выделенными из клеток меланомы человека A375. Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA с поправкой Тьюки для множественных сравнений. **, р < 0,01; ***, р < 0,001.

Чтобы проверить, необходимы ли MoDC для лицензирования цитотоксической активности опухоле-реактивных Т-клеток, опухолевые клетки пациента с меланомой инкубировали с аутологичными Т-клетками, выделенными из опухоли и PB. Опухолеинфильтрирующие Т-клетки индуцировали апоптоз примерно в 15% опухолевых клеток, тогда как Т-клетки крови были почти инертны. Добавление аутологичных инфильтрирующих опухоль MoDC (SSC lo /MHCII hi /CD11c + /CD14 lo-int ) к Т-клеткам крови способствовало гибели опухолевых клеток, сравнимой с таковой, наблюдаемой с инфильтрирующими опухоль Т-клетками ( фиг. 7C и D ).

Гистологические срезы первичной меланомы от пациента, резистентного к лечению PD-1, показали высокие уровни расщепленной каспазы-3 в большинстве инфильтрирующих опухоль DC ( фиг. 7E ). Наконец, в соответствии с нашими результатами на мышах, было обнаружено, что экзосомы, секретируемые из клеточной линии меланомы, индуцируют апоптоз в MoDC, выделенных от здоровых доноров ( рис. 7F и G ).

Обсуждение

Хотя иммунотерапия меланомы доказала свою эффективность даже при диссеминированном и метастатическом заболевании ( 4, 9 ), только у небольшой группы пациентов наблюдается полный лечебный ответ ( 8 ). Поэтому огромные научные усилия были вложены в выявление факторов, ограничивающих эффективность лечения. В нескольких исследованиях метаанализа клинических образцов была предпринята попытка определить генную сигнатуру, которая будет предсказывать реакцию пациентов с раком на иммунотерапию ( 3, 38 ). Общие параметры, которые определяют, ответит ли пациент, могут зависеть от драйверных мутаций, мутационной нагрузки, механизма представления антигена и неоантигенной нагрузки ( 39, 40) .), а также на иммунные параметры в микроокружении опухоли, такие как тип, распространенность, цитокиновая подпись и разнообразие TCR инфильтрирующих Т-клеток ( 3, 38, 41, 42 ).

Здесь мы использовали невосприимчивость больших опухолей меланомы у мышей к иммунотерапии, чтобы идентифицировать иммунные элементы, которые управляют иммунным ответом хозяина на меланому. Мы обнаружили, что проникающие в опухоль MoDC подвергаются апоптозу по мере прогрессирования меланомы; и в их отсутствие терапия на основе Т-клеток не будет работать. Исследование клинических биопсий показало положительную корреляцию между миелоидным инфильтратом опухоли и MoDC и благоприятными клиническими исходами при кожных меланомах ( 20, 43–45 ). Три десятилетия назад у пациентов с меланомой сообщалось о значительном снижении DC в эпидермисе по мере прогрессирования опухоли ( 43, 44, 46, 47 ). Эше и его коллеги были первыми, кто сообщил, что опухолевые факторы индуцируют апоптоз в ДК мыши и человека ( 48 ).). Попытки определить, какой производный от меланомы фактор индуцирует апоптоз ДК, показали, что ганглиозиды GM3 и GD3 индуцируют значительный апоптоз ДК в культуре за счет активации видов реактивного кислорода ( 49, 50 ). посредством лигирования с Siglec-3 ( 51 ). Примечательно, что это первый случай, когда лизосомы, полученные из меланомы, считаются основным механизмом, который индуцирует апоптоз в MoDC посредством индукции инфламмасомы и каспазы-1. Остается неясным, почему поглощение лизосом опухолеассоциированными макрофагами не сопровождается апоптозом.

В большинстве исследований положительная корреляция между инфильтрирующими опухоль ДК и благоприятным прогнозом связывается со способностью ДК мигрировать в сигнальные лимфатические узлы, где они примируют опухоле-реактивные Т-клетки ( 19, 20, 52–55 ). Мы обнаружили, что MoDC отличаются от cDC и эпидермальных DC, поскольку они не мигрируют в лимфоидные органы, а скорее остаются в опухолях и передают стимулирующие сигналы инфильтрирующим опухоль Т-клеткам. В соответствии с оригинальной работой Randolph ( 56 ), которая обнаружила, что моноциты, поглощающие латексные шарики, мигрируют в DLN и созревают, чтобы стать DC, мы обнаружили моноциты, но не зрелые MoDC, содержащие опухолевые антигены в лимфоидных органах. В ходе многочисленных клинических испытаний были предприняты попытки пульсации ex vivo.аутологичные MoDC с опухолевыми антигенами и повторно вводили их пациенту, чтобы вызвать Т-клеточный иммунитет ( 57, 58 ). Хотя пути инъекций играют важную роль в облегчении этого лечения ( 59 ), наша работа дает еще одно объяснение того, почему инъекция MoDC не оправдала ожиданий, активируя Т-клетки в анализах in vitro.

Точная природа лицензионного сигнала, который проникающие в опухоль MoDC обеспечивают Т-клеткам, остается неясной. Marigo и коллеги продемонстрировали, что проникающие в опухоль Tip DC, которые являются подмножеством MoDC, активируют проникающие Т-клетки посредством перекрестного связывания лиганда CD40 ( 60 ). Тем не менее, поскольку у CD40L отсутствует сигнальная цепь, более вероятно, что они активируют CD40 Tip-DC и что передача сигналов лицензирования является вторичной по отношению к взаимодействиям CD40-CD40L. Действительно, активация MoDC агонистическим анти-CD40, который блокирует последующие взаимодействия с CD40L на Т-клетках, вызывает значительный лизис опухолевых клеток Т-клетками.

В целом эта работа переопределяет роль MoDC в меланомах и, возможно, в других опухолях; это предполагает, что их основная роль заключается не в представлении опухолевых антигенов в сигнальных лимфатических узлах, а скорее в обеспечении сигналов лицензирования in situ для инфильтрирующих Т-клеток. Повышение жизнеспособности ДК у пациентов, не отвечающих на иммунотерапию, может существенно повысить эффективность лечения.

Раскрытие потенциальных конфликтов интересов

Возможные конфликты интересов выявлены не были.

Вклад авторов

Концепция и дизайн: Н. Сантана-Магал, П. Райдер, Ю. Карми

Разработка методики: Н. Сантана-Магал, И.Л. Линде, Ю. Карми

Сбор данных (предоставление животных, приобретение и лечение пациентов, предоставление помещений и т. д.): Н. Сантана-Магал, А. Глейберман, О. Злотник, И. Л. Линде, Н. Э. Ретикер-Флинн, Ю. Карми

Анализ и интерпретация данных (например, статистический анализ, биостатистика, вычислительный анализ): А. Глейберман, Д. Расулунириана, Л. Таль, Д. Нетанели, Р. Шамир, Р. Блау, И.Л. Линде, П. Райдер, Ю. Карми

Написание, рецензирование и/или доработка рукописи: Н. Сантана-Магал, Л. Фархат-Юнис, А. Гутвиллиг, А. Глейберман, Л. Таль, М. Файнмессер, П. Райдер, Ю. Карми

Административная, техническая или материальная поддержка (т.е. отчетность или систематизация данных, построение баз данных): Н. Сантана-Магал, Л. Фархат-Юнис, А. Гутвиллиг, М. Фейнмессер, О. Злотник, П. Райдер, Ю. Карми

Руководство исследованием: П. Райдер

Другое (техническая помощь в проведении исследований и анализе данных): Д. Расулунириана

Другое (хирург, занимающийся извлечением, отбором и сохранением опухолевой ткани): Х. Гутман .

Благодарности

Эта работа финансировалась Swiss Bridge Foundation, Израильской онкологической ассоциацией (номер гранта 20180041) и Израильским научным фондом (номер гранта 2262/18).

Авторы хотели бы выразить глубокую признательность Банку тканей Медицинского центра Рабина и особенно д-ру Адве Леви-Барда за их неоценимую поддержку этого исследования.

Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты оплатой страниц. Таким образом, эта статья должна быть помечена как реклама в соответствии с разделом 1734 18 USC исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

использованная литература

1.Геллер переменный ток,Клапп RW,Трезвый ЭйДжей,Гонсалвес л,Мюллер л,Кристиансен КЛ, и другие Эпидемия меланомы: анализ данных регистра опухолей Коннектикута за шесть десятилетий.Джей Клин Онкол

 2013;31:4172–8.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

2.Страницы Ф,Галон Дж,Дьё-Ножан МС,Тартур Е,Сотес-Фридман С,Фридман белый. Иммунная инфильтрация опухолей человека: прогностический фактор, который нельзя игнорировать.Онкоген

 2010;29:1093–102.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

3.Торссон В,Гиббс DL,Коричневый SD,Волк Д,Бортоне ДС,Оу Ян TH, и другие Иммунный ландшафт рака.Иммунитет

 2018;48:812–30.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

4.Розенберг ЮАР. Десятилетие в обзоре — иммунотерапия рака: вход в основное русло лечения рака.Нат Рев Клин Онкол

 2014;11:630–2.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

5.Рестифо НП,Дадли МНЕ,Розенберг ЮАР. Адоптивная иммунотерапия рака: использование ответа Т-клеток.Нат Рев Иммунол

 2012;12:269–81.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

6.Пардолл ДМ. Блокада иммунных контрольных точек при иммунотерапии рака.Нат Рев Рак

 2012;12:252–64.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

7.Ходи ФС,О’Дей СЖ,Макдермотт ДФ,Вебер RW,Сосман JA,Хаанен Джей Би, и другие Улучшение выживаемости при применении ипилимумаба у пациентов с метастатической меланомой.N Engl J Med

 2010;363:711–23.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

8.Шарма п,Эллисон Япония. Будущее терапии контрольных точек иммунитета.Наука

 2015;348:56–61.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

9.Постоу Массачусетс,Каллахан МК,Волчок Джей Ди. Блокада иммунных контрольных точек при лечении рака.Джей Клин Онкол

 2015;33:1974 г.–82.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

10.Хейворд НК,Уилмотт JS,Уодделл Н,Йоханссон Пенсильвания,Поле Массачусетс,Нет К, и другие Полногеномные ландшафты основных подтипов меланомы.Природа

 2017;545:175–80.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

11.Джойс JA,Ферон ДТ. Исключение Т-клеток, иммунная привилегия и микроокружение опухоли.Наука

 2015;348:74–80.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

12.Шумахер Теннесси,Шепер Вт,Квистборг п. Раковые неоантигены.Анну Рев Иммунол

 2019;37:173–200.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

13.Кусенс ЛМ,Зитвогель л,Палуцка АК. Нейтрализация хронического воспаления, способствующего развитию опухоли: волшебная пуля?Наука

 2013;339:286–91.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

14.Гаевский ТФ,Шрайбер ЧАС,Фу YX. Врожденные и адаптивные иммунные клетки в микроокружении опухоли.Нат Иммунол

 2013;14:1014–22.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

15.Палуцка К,Баншеро Дж. Терапевтические противораковые вакцины на основе дендритных клеток.Иммунитет

 2013;39:38–48.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

16.Милднер А,Юнг С. Развитие и функция субпопуляций дендритных клеток.Иммунитет

 2014;40:642–56.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

17.Мерад М,Сате п,Хельфт Дж,Миллер Дж,Морта А. Линия дендритных клеток: онтогенез и функция дендритных клеток и их субпопуляций в стационарном состоянии и при воспалении.Анну Рев Иммунол

 2013;31:563–604.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

18.Гиллиамс М,Жинхо Ф,Якубзик С,Наик Ш,Онаи Н,Шрамль БУ, и другие Дендритные клетки, моноциты и макрофаги: единая номенклатура на основе онтогенеза.Нат Рев Иммунол

 2014;14:571–8.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

19.Лосось ЧАС,Идояга Дж,Рахман А,Лебёф М,Примечание р,Иордания С, и другие Экспансия и активация предшественников дендритных клеток CD103(+) в месте опухоли усиливает ответ опухоли на терапевтическое ингибирование PD-L1 и BRAF.Иммунитет

 2016;44:924–38.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

20.Робертс РЭБ,Броз МЛ,Бинневис М,Хедли МБ,Нельсон АЕ,Волк ДМ, и другие Критическая роль дендритных клеток CD103(+)/CD141(+), несущих CCR7, для переноса опухолевого антигена и запуска Т-клеточного иммунитета при меланоме.Раковая клетка

 2016;30:324–36.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

21.Шахин U,Дерхованессян Е,Миллер М,Клоке АД,Саймон п,Ниже М, и другие Персонализированные РНК-мутаномные вакцины мобилизуют полиспецифический терапевтический иммунитет против рака.Природа

 2017;547:222–6.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

22.Отт Пенсильвания,Ху Z,Кескин БД,Шукла ЮАР,Солнце Дж,Бозым диджей, и другие Иммуногенная персональная неоантигенная вакцина для больных меланомой.Природа

 2017;547:217–21.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

23.Баттерфилд левый. Дендритные клетки в клинических испытаниях иммунотерапии рака: делаем ли мы успехи?Фронт Иммунол

 2013;4:454.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

24.Карми Д,Прествуд ТР,Спитцер МЗ,Линде Иллинойс,Шабон Дж,Ретикер-Флинн северо-восток, и другие Akt и SHP-1 являются внутренними контрольными точками DC для противоопухолевого иммунитета..JCI Insight

 2016;1:e89020.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

25.Карми Д,Спитцер МЗ,Линде Иллинойс,Берт БМ,Прествуд ТР,Перлман Н, и другие Аллогенные IgG в сочетании со стимулами дендритных клеток индуцируют противоопухолевый Т-клеточный иммунитет.Природа

 2015;521:99–104.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

26.Овервейк мир,Цунг А,Ирвин КР,Паркхерст Г-Н,Голец ТиДжей,Цунг К, и другие gp100/pmel 17 представляет собой мышиный антиген отторжения опухоли: индукция «само»-реактивных онкоцидных Т-клеток с использованием высокоаффинного модифицированного пептидного лиганда..J Эксперт Мед

 1998 г.;188:277–86.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

27.Кайсова В,Виеру А,Кумзакова Z,Глазерова С,Гусникова ЧАС,Вакова Н, и другие Иммунотерапия рака на основе врожденного иммунитета: модель мышиной меланомы B16-F10.BMC Рак

 2016;16:940.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

28.Фу Дж,Канне БД,Леонг М,Гликман левый,Маквиртер СМ,Лемменс Е, и другие Противораковые вакцины на основе агонистов STING могут излечивать установленные опухоли, устойчивые к блокаде PD-1..Sci Transl Med

 2015;7:283ра52.

Google ученый

пабмед

29.Курран Массачусетс,Монтальво Вт,Ягита ЧАС,Эллисон Япония. Комбинированная блокада PD-1 и CTLA-4 увеличивает количество инфильтрирующих Т-клеток и уменьшает количество регуляторных Т-клеток и миелоидных клеток в опухолях меланомы B16..Proc Natl Acad Sci USA

 2010;107:4275–80.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

30.Чжу ЭФ,Гай ЮАР,Опель CF,Кван ЧД,Сурана р,Михм МС, и другие Синергический врожденный и адаптивный иммунный ответ на комбинированную иммунотерапию антителами против опухолевого антигена и увеличенным периодом полувыведения ИЛ-2 из сыворотки.Раковая клетка

 2015;27:489–501.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

31.Полак Д,Зигрон А,Эли-Бершуер л,Шапира л,Нуссбаум грамм. Myd88 играет важную роль в ответе кератиноцитов на инфекцию Porphyromonas gingivalis..J пародонтальный реагент

 2019;54:396–404.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

32.Расулунириана Д,Сантана-Магал Н,Гутвиллиг А,Фархат-Юнис л,Вино Д,Саперия С, и другие Отдельная подгруппа клеток Th1, экспрессирующих FcgammaRI, проявляет опосредованную антителами цитотоксическую активность..Джей Клин Инвест

 2019;129:4151–64.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

33.Твайман-Сент-Виктор С,Речь ЭйДжей,Майти А,Ренган р,Паукен КЭ,Стелекати Е, и другие Радиация и блокада двойной контрольной точки активируют неповторяющиеся иммунные механизмы при раке..Природа

 2015;520:373–7.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

34.Спитцер МЗ,Карми Д,Ретикер-Флинн северо-восток,Квек SS,Мадхиредди Д,Мартинс мм, и другие Системный иммунитет необходим для эффективной иммунотерапии рака.Клетка

 2017;168:487–502.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

35.Замок Джей Си,Крайтер С,Дикманн Дж,Ниже М,ван де Ремер Н,де Граф Дж, и другие Использование мутанома для противоопухолевой вакцинации.Рак Рез

 2012;72:1081–91.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

36.Знакомьтесь К,Ван JX,Мичевич грамм,Дамский Вт,Бозенберг МВт. Линии YUMM: серия конгенных клеточных линий мышиной меланомы с определенными генетическими изменениями..Пигментно-клеточная меланома Res

 2016;29:590–7.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

37.Атлас генома рака N. Геномная классификация меланомы кожи.Клетка

 2015;161:1681–96.

перекрестная ссылка

пабмед

38.Аусландер Н,Чжан грамм,Ли JS,Фредерик ДТ,Мяо Б,Молл Т, и другие Надежное прогнозирование ответа на терапию блокадой иммунных контрольных точек при метастатической меланоме.Нат Мед

 2018;24:1545–9.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

39.Макгранахан Н,Фернесс ЭйДжей,Розенталь р,Рамсков С,Лингаа р,Шайни СК, и другие Клональные неоантигены вызывают иммунореактивность Т-клеток и чувствительность к блокаде иммунных контрольных точек..Наука

 2016;351:1463–9.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

40.Самштайн РМ,Ли CH,Шуштари АН,Хеллманн доктор медицины,Шен р,Джанджигян ГГ, и другие Мутационная нагрузка опухоли предсказывает выживаемость после иммунотерапии при различных типах рака.Нат Жене

 2019;51:202–6.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

41.Риаз Н,Гавел ДжейДжей,Макаров В,Десричард А,Урба WJ,Симс JS, и другие Эволюция опухоли и микроокружения при иммунотерапии ниволумабом.Клетка

 2017;171:934–49.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

42.Хьюго Вт,Зарецкий ДжМ,Солнце л,Песня С,Морено ЧД,Ху-Лиескован С, и другие Геномные и транскриптомные особенности ответа на терапию анти-PD-1 при метастатической меланоме.Клетка

 2016;165:35–44.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

43.Райхерт ТЭ,Шойер С,День р,Вагнер Вт,Уайтсайд TL. Количество внутриопухолевых дендритных клеток и экспрессия дзета-цепи в Т-клетках как прогностические биомаркеры и биомаркеры выживания у пациентов с карциномой полости рта.Рак

 2001 г.;91:2136–47.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

44.Ладаньи А,Целовать Дж,Сомлай Б,Гильде К,Фейос Z,Мохос А, и другие Плотность зрелых дендритных клеток DC-LAMP(+) в сочетании с активированными Т-лимфоцитами, инфильтрирующими первичную кожную меланому, является важным независимым прогностическим фактором..Рак Иммунол Иммунотер

 2007 г.;56:1459–69.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

45.Гок Дж,Жермен С,Во-Бурге ТК,Лупо А,Клейн С,Нокарт С, и другие Дендритные клетки в опухолеассоциированных третичных лимфоидных структурах сигнализируют о цитотоксическом иммунном контексте Th1 и подтверждают положительное прогностическое значение инфильтрирующих CD8+ Т-клеток..Рак Рез

 2014;74:705–15.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

46.Стене Массачусетс,бабаджанцев М,Бхута С,Кокран ЭйДжей. Количественные изменения кожных клеток Лангерганса при эволюции злокачественной меланомы кожи.Джей Инвест Дерматол

 1988 г.;91:125–8.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

47.Торияма К,Вэнь ДР,Павел Е,Кокран ЭйДжей. Изменения в распределении, частоте и фенотипе клеток Лангерганса при эволюции злокачественной меланомы кожи.Джей Инвест Дерматол

 1993 г.;100:269С–73С.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

48.Эше С,Локшин А,Шурин ГВ,Гастман BR,Рабинович ЧАС,Уоткинс СК, и другие Другие иммунные мишени опухоли: дендритные клетки.Дж. Лейкок Биол

 1999 г.;66:336–44.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

49.Пеге-Наварро Дж,Спортуч М,Попа я,Бертье О,Шмитт Д,Портукальский Дж. Ганглиозиды из опухолей меланомы человека нарушают дифференцировку дендритных клеток из моноцитов и индуцируют их апоптоз..Дж Иммунол

 2003 г.;170:3488–94.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

50.Беннасер К,Попа я,Чепмен JA,Мигдаль С,Пеге-Наварро Дж,Турень Дж.Л., и другие Различные механизмы вовлечены в апоптоз, индуцированный ганглиозидами меланомы на дендритных клетках, происходящих из моноцитов человека..гликобиология

 2009 г.;19:576–82.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

51.Исида А,Охта М,Тода М,Мурата Т,Усуи Т,Акита К, и другие Муцин-индуцированный апоптоз дендритных клеток, происходящих из моноцитов, во время созревания.протеомика

 2008 г.;8:3342–9.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

52.Спрангер С,Дай Д,Хортон Б,Гаевский ТФ. Опухолевые дендритные клетки Batf3 необходимы для переноса эффекторных Т-клеток и адоптивной Т-клеточной терапии..Раковая клетка

 2017;31:711–23.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

53.Ма Д,Аджемян С,Маттаролло СР,Ямадзаки Т,Аймерик л,Ян ЧАС, и другие Индуцированное противоопухолевой химиотерапией внутриопухолевое рекрутирование и дифференцировка антигенпрезентирующих клеток.Иммунитет

 2013;38:729–41.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

54.Кун С,Хайд ЭДж,Ян Дж,Богатый ФД,Харпер Дж.Л.,Кирман младший, и другие Увеличение количества дендритных клеток, происходящих из моноцитов, во время успешной иммунотерапии опухоли иммуноактивирующими агентами..Дж Иммунол

 2013;191:1984 г.–92.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

55.Броз МЛ,Бинневис М,Болдаджипур Б,Нельсон АЕ,Минтай Дж.Л.,Эрле диджей, и другие Вскрытие миелоидного компартмента опухоли выявляет редкие активирующие антигенпрезентирующие клетки, критические для Т-клеточного иммунитета..Раковая клетка

 2014;26:638–52.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

56.Рэндольф ГД,Инаба К,Роббиани ДФ,Штейнман РМ,Мюллер Вашингтон. Дифференцировка фагоцитирующих моноцитов в дендритные клетки лимфатических узлов in vivo.Иммунитет

 1999 г.;11:753–61.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

57.Ангилья С,Смитс ЭЛЬ,Лев Е,ван Тенделоо ВФ,Бернеман ЗН. Клиническое использование дендритных клеток для лечения рака.Ланцет Онкол

 2014;15:е257–67.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

58.Виммерс Ф,Шрайбельт грамм,Скольд АЕ,Фигдор компьютерная графика,Де Врис ИЖ. Сдвиг парадигмы в иммунотерапии на основе дендритных клеток: от генерируемых in vitro дендритных клеток, полученных из моноцитов, к естественным циркулирующим подмножествам дендритных клеток.Фронт Иммунол

 2014;5:165.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

59.Фонг л,Брокштедт Д,Бенике С,Ву л,Энглеман НАПРИМЕР. Дендритные клетки, вводимые разными путями, вызывают иммунитет у больных раком.Дж Иммунол

 2001 г.;166:4254–9.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед

60.Мариго я,Зилио С,Десантис грамм,Млечник Б,Аньеллини AHR,Угель С, и другие Терапия Т-клеточного рака требует активации CD40-CD40L фактора некроза опухоли и дендритных клеток, продуцирующих индуцибельную оксид азота-синтазу..Раковая клетка

 2016;30:377–90.

Google ученый

перекрестная ссылка

пабмед©2020 Американская ассоциация исследований рака.